UJIAN AKHIR SEMESTER

UJIAN AKHIR SEMESTER

MATA KULIAH       : KIMIA BAHAN ALAM

SKS                             : 2

DOSEN                      : Dr. Syamsurizal, M.Si

WAKTU                     : 22-29 Desember 2012

PETUNJUK : Ujian ini open book. Tapi tidak diizinkan mencontek, bilamana ditemukan, maka anda dinyatakan GAGAL. Jawaban anda diposting di bolg masing-masing.

1.      Jelaskan dalam jalur biosintesis triterpenoid, identifikasilah faktor-faktor penting yang sangat menentukan dihasilkannya triterpenoid dalam kuantitas yang banyak.

2.     Jelaskan dalam penentuan struktur flavonoid, kekhasan signal dan intensitas serapan dengan menggunakan spektrum IR dan NMR. Berikan dengan contoh sekurang-kurangnya dua struktur yang berbeda.

3.Dalam isolasi alkaloid, pada tahap awal dibutuhkan kondisi asam atau basa. Jelaskan dasar penggunaan reagen tersebut, dan berikan contohnya sekurang-kurangnya tiga macam alkaloid.

4.Jelaskan keterkaitan diantara biosintesis, metode isolasi dan penentuan struktur senyawa bahan alam . Berikan contohnya.

Jawab :

1.      Secara umum biosintesa dari terpenoid dengan terjadinya 3 reaksi dasar yaitu :

 Pembentukan isopren aktif berasal dari asam asetat melalui asam mevalonat , Penggabungan kepala dan ekor dua unit isopren akan membentuk mono-, seskui-, di-, sester- dan poli-terpenoid , Penggabungan ekor dan ekor dari unit C-15 atau C-20 menghasilkan triterpenoid dan steroid.

 

Gambar 1. Jalur asetat dalam pembentukan IPP yang merupakan batu bata pembentukan terpenoid via asam mevalonat (Dewick, 1997)

Mekanisme dari tahap-tahap reaksi biosintesa terpenoid adalah asam asetat setelah diaktifkan oleh koenzim A melakukan kondensasi jenis Claisen menghasilkan asam asetoasetat. Senyawa yang dihasilkan ini dengan asetil koenzim A melakukan kondensasi jenis aldol menghasilkan rantai karbon bercabang sebagaimana ditemukan pada asam mevalinat. reaksi-reaksi berikutnya adalah fosforilasi, eliminasi asam fosfat dan dekarboksilasi menghasilkan Isopentenil pirofosfat (IPP) yang selanjutnya berisomerisasi menjadi Dimetil alil pirofosfat (DMAPP) oleh enzim isomerase. IPP sebagai unit isopren aktif bergabung secara kepala ke ekor dengan DMAPP dan penggabungan ini merupakan langkah pertama dari polimerisasi isopren untuk menghasilkan terpenoid. Penggabungan ini terjadi karena serangan elektron dari ikatan rangkap IPP terhhadap atom karbon dari DMAPP yang kekurangan elektron diikuti oleh penyingkiran ion pirofosfat yang menghasilkan Geranil pirofosfat (GPP) yaitu senyawa antara bagi semua senyawa monoterpenoid. Penggabungan selanjutnya antara satu unit IPP dan GPP dengan mekanisme yang sama menghasilkan Farnesil pirofosfat (FPP) yang merupakan senyawa antara bagi semua senyawa seskuiterpenoid. senyawa diterpenoid diturunkan dari Geranil-Geranil Pirofosffat (GGPP) yang berasal dari kondensasi antara satu unit IPP dan GPP dengan mekanisme yang sama.

Triterpenoid terdiri dari kerangka dengan 3 siklik 6 yang bergabung dengan siklik 5 atau berupak 4 siklik 6 yang mempunyai gugus fungsi pada siklik tertentu.

Lebih dari 4000 jenis triterpenoid telah diisolasi dengan lebih dari 40 jenis kerangka dasar yang sudah dikenal dan pada prinsipnya merupakan proses siklisasi dari skualen.

Percobaan-percobaan menunjukkan bahwa skualen terbentuk dari dua molekul farnesil pirofosfat yang bergabung secara ekor-ekor yang segera diubah menjadi 2,3-epoksiskualen. selanjutnya lanosterol terbentuk oleh kecenderungan 2,3-epoksiskualen yang mengandung lima ikatan rangkap untuk melakukan siklisasi ganda. Siklisasi ini diawali oleh protonasi guigus epoksi dan diikuti oleh pembukaan lingkar epoksida.

2.      *Spektrofotometri Inframerah

Spektrum inframerah senyawa kimia bahan alam dapat diukur dengan spektrofotometer FTIR yang merekam secara otomatis dalam keadaan larutan (dalam kloroform, karbon tetraklorida, 1-5%), bentuk gerusan dalam minyak nujol, atau bentuk padatan yang dicampur dengan kalium bromida. Pengukuran mulai dari 4000-667 cm-1 (2,5-15 μm). Daerah pada spektrum inframerah di atas 1200 cm-1 menunjukkan pita spektrum atau puncak yang disebabkan oleh getaran ikatan kimia atau gugus fungsi dari molekul. Daerah di bawah 1200 cm-1 menunjukkan pita yang disebabkan oleh getaran seluruh molekul dan karena kerumitannya dikenal sebagai daerah sidik jari. Intensitas berbagai pita direkam secarasubjektif pada skala sederhana kuat, menengah, atau lemah. Spektrofotometri Infra Merah merupakan cara paling sederhana dalam menentukan golongan senyawa (Kunert et al. 2000).

*SPEKTROSKOPI H-NMR

Spektrometri NMR pada dasarnya merupakan spektrometri absorbsi, sebagaimana spektrometri infra merah maupun ultraviolet. Pada kondisi yang sesuai, suatu sampel dapat mengabsorpsi radiasi elektromagnetik daerah frekuensi radio, pada frekuensi yang tergantung dari sifat-sifat sampel. Suatu plot dari frekuensi puncak-puncak absorbsi versus intensitas puncak memberikan suatu spektrum NMR.

      Penentuan struktur  Flavonoid dalam Rimpang Temu Ireng (Curcuma aeruginosa Roxb.)

Analisis menggunakan spektrofotometer IR untuk menentukan gugus-gugus fungsional senyawa yang berada pada fraksif2 . Berdasarkan Gambar 3 tersebut dapat dilihat adanya pitakuat pada 1714,6 cm-1 yang spesifikuntuk gugus karbonil. Serapan tajam pada 1261,4 cm1 dan 1217,0 muncul dari vibrasi gugus C-O yang terkonjugasi. Pita pada 1091,6 dan 1029,9 cm-1 merupakan serapan dari gugus metoksi. Pita pada 3020,3 cm-1 berasal dari =C-H str dengan didukung oleh pita-pita antara 1600 cm-1 dan 1500 cm-1 menunjukkan keberadaan inti aromatis. Pita kecil lemah yaitu pada 1652,9 cm-1 berasal dari gugus vinyl. Pita-pita pada daerah dibawah 3000 cm-1 dan diperkuat oleh pita-pita disekitar 1450 cm-1 menyatakan adanya alkyl yaitu metilen. Berdasarkan analisis terhadap spektrum dapat disimpulkan bahwa f2 mengandung senyawa aromatis, gugus C=O, C-O, vinyl, -CH2- dan gugus metoksi. Untuk penentuan struktur senyawa pada fraksi f2, maka dilakukan analisis dengan alat kromatografi gas dilanjutkan dengan spektra massa.

      Penentuan struktur senyawa  Flavonoid dari Kulit Batang Tumbuhan

Saccopetalum horsfieldii Benn

Analisis spektroskopi infra merah dengan pellet KBr memberikan informasi bahwa senyawa flavonoid mempunyai gugus fungsi antara lain hidroksi, karbonil, eter, alkena dan cincin aromatis. Pita serapan pada bilangan gelombang 3204,05 cm-1 merupakan vibrasi ulur OH aromatis. Pita serapan 2924,35 cm-1 merupakan vibrasi ulur C-H aromatis, sedangkan gugus keton terkonjugasi ditunjukkan pada pita serapan 1662,79 cm-1. Pada pita serapan 1595,27 cm-1 menunjukkan adanya ikatan rangkap cincin aromatis dan pita serapan dengan bilangan gelombang 823,68 cm-1 menunjukkan adanya aromatis. Gugus C-O-C ditunjukkan pada bilangan gelombang 1311,03 cm-1 [11].Analisis spektroskopi 1H-RMI memberikanpergeseran kimia pada signal (ppm) : 12,67; 7,58 (d,J=2,2 Hz); 7,48 dan 7,46 (1H, dd, J=2,2 & 6,10 Hz); 6,91(1H, d, J=8,30 Hz); 6,68 (1H, J=2,2 Hz); 6,35 (1H, J=2,2Analisis spektroskopi 13C-RMI memberikanpergeseran kimia pada signal (ppm): 55,875; 59,488;92,008; 97,485; 104,976; 115,362; 115,502; 120,403;120,502; 137,652; 144,994; 148,558; 155,702;155,991; 160,693; 164,818; 177,712. Dari analisis spektroskopi UV, IR dan RMI menunjukkan bahwa senyawa flavonoid hasil isolasi adalah 3,7-dimetoksi kuersetin atau kuersetin 3,7- dimetil eter.

3.Alkaloid merupakan senyawa organik aktif yang mengandung unsur nitrogen, sehingga bersifat sedikit basa.Sifat kebasaan ini dapat digunakan sebagai dasar isolasi alkaloid dari suatu bahan alam.Isolasi alkaloid dapat menggunakan pelarut metanol yang mengandung asam asetat, alkaloid tersebut akan terlarut didalam asam asetat sedangkan bahan lain tidak. Kemudian alkaloid dapat diperoleh kembali dengan menambahkan basa amoniak sehingga alkaloid dapat mengendap kembali.

Satu-satunya sifat kimia alkaloid yang paling penting adalah kebasaannya. Metode pemurnian dan pencirian ialah umumnya mengandalkan sifat ini, dan pendekatan khusus harus dikembangkan untuk beberapa alkaloid misalnya rutaekarpina, kolkhisina, risinina) yang tidak bersifat basa.Umumnya isolasi bahan bakal sediaan galenik yang mengandung alkaloid dilakukan dengan beberapa cara, yaitu :

·         Dengan menarik menggunakan pelarut-pelarut organik,yaitu alkaloida disekat pada pH tertentu dengan pelarut organik(Azas Keller).

·         Pemurnian alkaloida dapat dilakukan dengan cara modern yaitu dengan pertukaran ion.

·         Menyekat melalui kolom kromatografi dengan kromatografi partisi.

Cara kedua dan ketiga merupakan cara yang paling umum dan cocok untuk memisahkan campuran alkaloid. Tata kerja untuk mengisolasi dan mengidentifikasi alkaloid yang terdapat dalam bahan tumbuhan yang jumlahnya dalam skala milligram menggunakan gabungan kromatografi kolom memakai alumina dan kromatografi kertas.

a.) Isolasi alkaloid Dalam Strychnos ligustrida Bl. (Loganiaceae) dengan cara Ekstraksi

 Strychnos ligustrida Bl. (Loganiaceae) adalah tanaman obat yang banyak ditemukan di Nusa Tenggara Barat. Di daerah Bima (Sumbawa, NTB) tanaman ini dikenal dengan nama Songa. Menurut informasi penduduk setempat, batang Songa dipergunakan sebagai tanaman obat tradisional untuk pengobatan penyakit malaria. Selain digunakan untuk pengobatan penyakit malaria, tumbuhan ini banyak dikenal sebagai tanaman multiguna. Hampir seluruh bagian tanaman ini dapat digunakan secara tradisional untuk mengobati bermacam-macam penyakit seperti demam, sariawan, diare, jantung, penawar racun, pembersih darah, obat kuat (tonikun), bisul, borok dan pembersih jerawat (1). Studi kimia pada tumbuhan keluarga Strychnos telah banyak dilakukan. Massiot (1988) melaporkan 20 jenis alkaloid dari Strychnos matopensi (2). Sementra Bisset (1974) menemukan senyawa alkaloid icajin dan novacin sebagai senyawa utama pada Strychnos wallichiana dan S. henningsii (3,4). Penelusuran daftar pustaka terhadap struktur kimia Strychnos ligustrida Bl., belum banyak yang melakukan. Tulisan ini melaporkan hasil penelitian studi kimia tanaman obat tradisional Indonesia tentang isolasi dan identifikasi senyawa alkaloid pada Strychnos ligustrida Bl. Sebelumnya telah dilaporkan dua senyawa alkoloid yang telah berhasil diisolasi dan diidentifikasi strukturnya (5). Sedangkan pada tulisan ini dilaporkan hasil isolasi dan identifikasi dari dua fraksi lainnya, yaitu fraksi IV yang memberikan senyawa brusin (3) dan fraksi V yang memberikan senyawa brusin N-oksida (4).

Ø  Ekstraksi

Ekstraksi. Sebanyak satu kilogram batang (kulit dan kayu) Songa dikeringkan dan dipotong-potong kecil. Kemudian diekstraksi dengan 500 ml metanol (teknis) panas sebanyak tiga kali. Campuran selanjutnya disaring dan pekatkan dengan penguapan berpusing bertekanan rendah (Yamato 50 RE). Ekstrak metanol yang diperoleh kemudian diuji dengan kromatografi lapis tipis (KLT). Untuk uji KLT ini digunakan lempeng aluminium silika gel 60 F254 dengan ketebalan lapisan 0,2 mm (Merck) dan pendeteksian noda dilakukan dengan menggunakan penyemprot CeSO4/10% H2SO4 pekat.

Ø  Isolasi

Isolasi. Ekstrak metanol kasar selanjutnya dipisahkan dengan kromatografi kolom kieselgel 60 (35 - 70 mesh ASTM, Merck) sebagai fase diam, sedangkan eluen yang digunakan adalah campuran kloroform : metanol (50:1 1: 1) dan terakhir digunakan metanol. Kromatografi kolom memberikan beberapa fraksi, empat fraksi diantaranya yaitu fraksi II dan fraksi III memberikan senyawa klorobrin N-oksida (1) dan striknin N-oksida (2) (5), dan dua fraksi lainnya yaitu fraksi IV dan V dimurnikan lebih lanjut dengan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT JASCO, model MD 910 dengan detektor UV/VIS multi panjang gelombang). Kolom yang digunakan adalah jenis fase balik (reversed phase), BondapakTM C-18, 300 x 9,9 mm yang dialiri dengan eluen metanol (5:1) secara isokratik dan hasilnya adalah dua senyawa murni brusin (3) dan brusin N-oksida (4). Skema prosedur isolasi dan pemurnian senyawa alkaloid dari Strychnos lugistida Bl. Dapat dilihat pada Gambar 1.

b.) Isolasi Nikotin Dari Daun Tembakau (Nicotiana tabacum) dengan cara penyulingan uap

Nikotin adalah suatu alkaloid dengan nama kimia 3-(1-metil-2-pirolidil) piridin. Saat diekstraksi dari daun tembakau, nikotin tak berwarna, tetapi segera menjadi coklat ketika  bersentuhan dengan udara. Nikotin dapat menguap dan dapat dimurnikan dengan cara penyulingan uap dari larutan yang dibasakan.

Alkaloid diekstrak dari tumbuhan yaitu daun, bunga, buah, kulit, dan akar yang  dikeringkan lalu dihaluskan. Cara ekstraksi alkaloid secara umum adalah sebagai berikut :

Ø   Alkaloid   diekstrak   dengan   pelarut   tertentu,   misalnya   dengan   etanol, kemudian diuapkan.

Ø  Ekstrak yang diperoleh diberi asam anorganik untuk menghasilkan garam amonium kuartener kemudian diekstrak kembali.

Ø  Garam  amonium  kuartener  yang  diperoleh  direaksikan  dengan  natrium karbonat  sehingga  menghasilkan  alkaloid–alkaloid  yang  bebas  kemudian diekstraksi dengan pelarut tertentu seperti eter dan kloroform.

Ø  Campuran – campuran alkaloid yang diperoleh akhirnya dipisahkan melalui berbagai cara, misalnya metode kromatografi (Tobing, 1989).

Ada cara  lain  untuk  mendapatkan  alkaloid  dari  larutan  asam  yaitu  dengan penyerapan  memakai pereaksi Lloyd, kemudian alkaloid dielusi dengan basa encer. Alkaloid yang bersifat hidrofob diserap dengan damar XAD-2 lalu dielusi dengan asam atau campuran etanol-air. Banyak alkaloid yang dapat diendapkan dengan pereaksi Mayer (kalium raksa (II) iodida) atau garam Reineccke.

Dalam penelitian ini digunakan cara isolasi alkaloid secara umum yaitu mengekstrak       dengan            pelarut            organik,           pengasaman,    pembentukan   garam amonium   kuartener   dengan   basa,   ekstraksi   dengan   pelarut   organik,   dan pemurnian menggunakan kromatografi kolom, kromatografi lapis tipis, ataupun instrumen-instrumen elektronik (IR,GC-MS,UV-Vis).

c.) Isolasi Purin pada Bunga kering F. vulgare

Bunga kering F. vulgare (350 g) diekstraksi dengan 95% etanol (5 L) untuk menghasilkan residu kering(68 g). 50 g residu disuspensi dengan air (250 mL) dan dipartisi dengan petroleum eter (7,4 g), kloroform (2 g), etil asetat (4 g) and n-butanol (4 g).

Ekstrak etil asetat dikromatografi dengan 40 g Silika Gel H di Vacuum Liquid Chromatography Column (VLC) (13 x 4 cm). Elusi dengan menggunakan kloroform dan tingkatkan polaritas dengan 5% etil asetat, lakukan elusi bertahap sampai 100% etil asetat (40×100 mL) dan kemudian polaritas ditingkatkan kembali dengan 5% metanol bertahap  hingga 75% etil asetat-25% metanol (15 x 100 mL).

Fraksi 16 dan 17 (99 mg) digabungkan dan dimurnikan di kolom Sephadex LH-20 (40 x 2 cm) menggunakan metanol sebagai eluen untuk memberikan senyawa 1 (43 mg).

Fraksi 28-30 (110 mg) dan Fraksi 35 dan 36 (100 mg) diperlakukan secara terpisah seperti yang dijelaskan dari 1 untuk menghasilkan masing-masing 2 (18 mg) dan 4 (12 mg).

ü  Fraksi 39 dan 40 (523 mg) yang disaring pada kolom Sephadex LH-20 (40 x 2 cm) menggunakan metanol sebagai eluen dan kemudian dikromatografi di 25 g Si gel kolom (25 x 1,5 cm) di elusi dengan 4:1 kloroform / metanol untuk memberikan 5 (25 mg).

ü  Fraksi 41-48 (590 mg) disaring di Sephadex LH-20 kolom (40 x 2 cm) dan kemudian dimurnikan dengan menggunakan pelarut TLC preparative (sebuah sistem untuk menghasilkan 6 (8 mg).

ü  Pecahan 52-55 (90 mg), dimurnikan pada kolom sephadex (40 x 2 cm) untuk menghasilkan senyawa 7 (36 mg).

ü  Daun (600 g) dan buah (400 g) F. vulgare, serta bunga (250 g) dan buah (700 g)
Daun F. vulgare menghasilkan 8 mg senyawa 3 yang ada hanya dalam daun, 9 mg senyawa 5, dan 15 mg senyawa 7. Buah F. vulgare hanya menghasilkan 6 mg senyawa 7.

ü  Kaempferol-3-O-α-L-(2 “, 3″-E-di-p-coumaroyl)-rhamnoside (1). Bubuk amorf kuning (43 mg). Hidrolisis senyawa yang terisolasi Beberapa mg glikosida yang direflux dengan 10% HCl dalam 50% methanol selama 3 jam. Fraksi aglikon dan gula diidentifikasi dengan kromatografi dibandingkan dengan sampel otentik.

4. Secara tradisional kimia bahan alam berhubungan dengan isolasi, penentuan struktur dan sintesis senyawa-senyawa organik yang berasal dari sumber alam hayati.

Isolasi dan penentuan struktur senyawa bahan alam, pada hakekatnya, menindak lanjuti dan mengembangkan pengetahuan tentang penggunaan tumbuh-tumbuhan dalam pengobatan tradisional.

     Pertumbuhan kimia bahan alam yang semula terfokus pada isolasi senyawa yang mudah diperoleh mengalami pertumbuhan yang pesat dalam aspek penetapan struktur, didorong oleh kemajuan dalam instrumentasi, dengan ditemukannya teknik-teknik pemisahan kromatografi dan teknik-teknik spektroskopi ultra violet (uv), infra merah (ir),resonansi magnet inti  (nmr), massa (ms), dan kristalografi sinar-X, serta sintesis. Memasuki milenium ke-3 penentuan struktur dan sintesis seperti penisilin, striknin,klorofil, vitamin B12, hemoglobin, dll. Telah merupakan hal rutin. Pertumbuhan selanjutnya bergeser dan terfokus pula aspek-aspek struktur dan mekanisme interaksi ligan-reseptor biopolimer berlandaskan struktur molekul yang pasti dalam rangka memahami biosintesis dan bioaktivitas. Pengetahuan tentang struktur pada tingkat molekuler mencerminkan sifat-sifat dan fungsi, dan terungkapnya korelasi tersebut membuka tantangan baru untuk menjelaskan dan mensistesis sistem kimia yang kompleks. Jadi, pengetahuan kimia bahan alam yang sangat penting ini mewujudkan berbagai harapan dan kemungkinan baru.

Contoh: Isolasi dan identifikasi Nikotin Dari Daun Tembakau (Nicotiana tabacum)

Biosintesis nikotin

Jalur biosintesis nikotin melibatkan reaksi penghubung antara dua struktur siklik yang membentuk nikotin. Studi metabolik menunjukkan bahwa cincin piridin nikotin berasal dari asam nikotinat sementara pirolidon ini berasal dari N-metil-Δ1-pyrrollidium kation. [18] [19] The biosintesis dari dua struktur komponen hasil sintesis melalui dua independen, jalur NAD untuk asam nikotinat dan tropane cara N-metil-Δ1-pyrrollidium kation.

Jalan NAD di Nicotiana genus dimulai dengan oksidasi asam aspartat dalam suksinat α-imino dari oksidase aspartate (AO). Hal ini diikuti dengan kondensasi dengan gliseraldehida-3-fosfat dan siklisasi dikatalisis oleh sintase quinolinate (QS) untuk memberikan asam quinolinic. Asam Quinolinic bereaksi dengan dikatalisis pirofosfat phosphoriboxyl oleh phosphoribosyl asam quinolinic transferase (QPT) untuk membentuk asam nikotinat mononukleotida (namn). Reaksi berlangsung sekarang melalui siklus pemulihan NAD untuk menghasilkan asam nikotinat melalui konversi nicotinamide dari enzim nicotinamidase.

Kation N-metil-Δ1-pyrrollidium digunakan dalam sintesis nikotin adalah perantara dalam sintesis turunan tropane alkaloid. Biosintesis dimulai dengan dekarboksilasi dari ornithine dekarboksilase ornithine oleh (ODC) untuk menghasilkan putresin. Putresin kemudian diubah menjadi N-metil putresin oleh metilasi dikatalisis oleh SAM putresin N-methyltransferase (PMT). N-methylputrescine kemudian mengalami deaminasi dalam 4-methylaminobutanal dari N-methylputrescine oksidase (MPO) enzim, 4-methylaminobutanal kemudian cyclize spontan di N-metil-Δ1-pyrrollidium kation.

Langkah terakhir dari sintesis nikotin adalah kopling antara N-metil-Δ1-pyrrollidium kation dan asam nikotinat. Meskipun studi menyimpulkan beberapa bentuk penghubung antara dua komponen struktur, proses dan mekanisme yang ditetapkan masih belum ditentukan. Teori saat ini disepakati melibatkan konversi dari asam nikotinat di 2,5-dihydropyridine 3,6-melalui asam dihydronicotinic. The 2,5-dihydropyridine menengah kemudian akan bereaksi dengan N-metil-Δ1-pyrrollidium kation untuk membentuk enansiomer murni (-)-nikotin

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI NIKOTIN DARI DAUN TEMBAKAU (Nicotiana tabacum       

Tembakau merupakan jenis tanaman yang sangat dikenal di kalangan masyarakat  Indonesia. Tanaman ini tersebar di seluruh Nusantara dan mempunyai kegunaan yang sangat banyak terutama untuk bahan baku pembuatan rokok. Kandungan alkaloid nikotin yang terdapat di daun tembakau dapat digunakan sebagai insektisida. Rokok adalah perantara utama bagi nikotin masuk ke tubuh manusia melalui asapnya., sehingga perlu diteliti nikotinnya.

a.  Isolasi Nikotin dari daun tembakau          

1.      25 gram daun tembakau kering rajangan yang telah dibungkus kertas saring  dimasukkan ke dalam alat soxhlet, dilakukan ekstraksi dengan menggunakan 300  mL metanol selama 7 jam. Sampel yang digunakan adalah 100 gram sehingga ekstraksi dilakukan 4 kali.

2.      Ekstrak / filtrat yang dihasilkan dievaporasi sampai dihasilkan larutan yang pekat atau filtrat tinggal 10 % dari volume semula.

3.      Larutan  pekat  dituangkan  ke  dalam  labu  erlenmeyer  dan  diasamkan dengan H2SO4  2 M sebanyak 25 mL. Larutan diaduk dengan magnetik stirer  agar   homogen.  Larutan  diuji  dengan  kertas  lakmus  sampai berwarna merah.  Kemudian larutan diekstrak dengan kloroform 25 mL sebanyak 3 kali dengan corong pisah.

4.      Ekstrak yang dihasilkan berada di lapisan bawah diuji dengan reagen Dragendorf, positip alkaloid jika timbul endapan orange.

5.      Ekstrak  dinetralkan  lagi  dengan  menambahkan  NH4OH,  kemudian diekstraksi lagi dengan kloroform 25 mL sebanyak 3 kali.

6.      Ekstrak         yang    diperoleh         diuapkan         dengan            dianginkan, kemudian dimurnikan  dengan  kromatografi  kolom  dengan  silika  gel  11,5  gram  sebagai fase  diam, panjang kolom 10 cm, diameter kolom 3 cm dan dengan eluen n heksana  dan kloroform, metanol dengan perbandingan 1:0, 7:3, 5:5, 3:7 dan 0:1 masing – masing sebanyak 10 mL.

7.      Hasil kromatografi kolom dilanjutkan dengan kromatografi lapis tipis dengan larutan pengembang metanol.

8.      Hasil ekstrak kemudian diuji dengan menggunakan GC–MS, spektrofotometer UV-Vis dan Spektrofotometer IR.

b.  Hasil  Identifikasi Senyawa dalam Ekstrak Daun Tembakau

ü  Hasil  Spektrofotometer  Inframerah  (IR)  dalam  Ekstrak  Daun  Tembakau Fraksi Metanol

Spektrofotometer infra merah digunakan untuk menganalisis gugus fungsi dari senyawa  kimia  yang  terdapat  pada  daun  tembakau  dengan  pelarut  metanol.  Uji dengan  spektrometer  infra  merah  menghasilkan  spektra  IR  seperti  tampak  pada gambar 8.

Gambar 8. Spektrum infra merah hasil kromatografi kolom fraksi keenam

Hasil identifikasi ekstrak tembakau fraksi metanol dengan menggunakan spektrofotometer  IR  menunjukkan  adanya  serapan  yang  khas  di  daerah  bilangan gelombang 2950,9 cm-1  dan 2838,0 cm-1  menunjukkan adanya ikatan C – H , pada bilangan gelombang 1651,0 cm-1  menunjukkan adanya gugus aromatis, pada bilangan gelombang 1458,1 cm-1  menunjukkan adanya gugus –CH3  , pada bilangan gelombang

1396,4 cm-1  menunjukkan adanya gugus amina tersier aromatis, dan pada bilangan gelombang 1018,3 cm-1  menunjukkan adanya amina tersier alifatis. Adanya serapan pada  bilangan   gelombang  3398,3  menunjukkan  adanya  gugus  –OH.  Hal  ini dikarenakan penggunaan pelarut metanol pada saat kromatografi kolom.

                                                           

ü  Hasil  Uji  dengan  Spektrofotometer  UV  Ekstrak  Daun  Tembakau  Fraksi Metanol

Spektrofotometri  UV  digunakan  untuk  senyawa  organik  yang  berhubungan dengan  transisi elektronik pada tingkat–tingkat energi elektron tertentu. Biasanya senyawa yang terukur mempunyai ikatan rangkap terkonjugasi. Nikotin mempunyai ikatan rangkap terkonjugasi pada cincin piridinnya. Hasil spektrum UV dari ekstrak daun tembakau dapat dilihat pada gambar 9.

   

Gambar 9. Spektrum UV-Vis dari ekstrak daun tembakau

Dari gambar  spektrum  di  atas  dapat  dilihat  bahwa  ekstrak  daun  tembakau mempunyai  panjang  gelombang  206  nm  dan  262  nm.  Dari  literatur  diperoleh panjang gelombang  maksimum cincin piridin adalah 251 nm (π→π*) dan 270 nm (n→π*) dalam  etanol.  Perbedaan  serapan  maksimum  mungkin  disebabkan  oleh perbedaan pelarut yang digunakan.